Ninja Gaiden представляет собой классический двухмерный платформер с горизонтальной прокруткой, игрок управляет персонажем Рю Хаябусой, сражающимся с противниками в ходе шести так называемых «актов», которые в сумме составляют 20 отдельных уровней. Физическое состояние героя выражено шкалой жизней, убывающей каждый раз, когда тот сталкивается с врагом или получает ранение в результате выстрела. При полном истечении шкалы персонаж теряет одну «жизнь», к тому же исходу приводят истечение отведённого на прохождение уровня времени (150 секунд) и падение в пропасть. В случае потери последней жизни игра заканчивается проигрышем, при этом игрок имеет неограниченное количество продолжений, позволяющих возобновить игровой процесс с того же уровня. Почти все враги на уровнях умирают с одного удара, но бесконечно появляются вновь, если вернуться персонажем в их зону обитания. В конце каждого акта Рю сражается с боссом, сильным противником, имеющим собственную шкалу жизней. Герою противостоят члены «Коварной четвёрки», прихвостни главного антагониста повествования — Джакио, победа над которым остаётся целью игры на протяжении большей части прохождения.

Второй уровень четвёртого акта, герой держит путь через подземелье
Важнейшим элементом геймплея является способность Рю прицепляться к вертикальным поверхностям и с силой отталкиваться от них в противоположную сторону. Если рядом расположены две стены, персонаж может забраться по ним сколь угодно высоко, кроме того, данный навык помогает преодолевать большие пропасти — выполнив прыжок, герой зацепляется сначала за край платформы, а потом уже с помощью такого отталкивания забирается на неё сверху. Также он с лёгкостью карабкается по стенам, которые снабжены лестницами.

В качестве основного оружия Рю использует меч дракона — катану, передаваемую по наследству реликвию клана Хаябуса. Помимо этого, он также может применять «вспомогательные» приёмы, запас которых ограничен «духовной силой»: бросок метательной звёздочки, возвращающейся назад подобно бумерангу; призыв огненных шаров, называемых здесь «техникой огненного колеса», и сальто в прыжке с одновременным рубящим ударом. В случае, когда шкала духовной силы слишком мала, герой не может пользоваться вспомогательными приёмами — для её пополнения необходимо собирать соответствующие предметы, появляющиеся после удара мечом по «призовым иконкам», развешенным на протяжении всех уровней. Среди прочих предметов — песочные часы, на пять секунд останавливающие все враждебные объекты; контейнер с бонусными очками; зелье, восстанавливающее шесть пунктов шкалы здоровья; «непреодолимое огненное колесо», на некоторое время делающее Рю неуязвимым для всех вражеских атак; одна жизнь.